Сетевое издание "Медицина и образование в Сибири"
 
 
  

 
№ 4 - 2016 г.
14.00.00 медицинские науки
(14.03.00 Медико-биологические науки)

УДК 576.535

ОЦЕНКА ЦИТОТОКСИЧНОСТИ И АПИРОГЕННОСТИ БИОДЕГРАДИРУЕМОГО ПОЛИЛАКТИДНОГО МАТРИКСА

К. В. Зайцев, О. Б. Жукова, И. А. Хлусов, А. А. Гостюхина, Н. Г. Абдулкина, С. И. Твердохлебов, Н. П. Степаненко, А. А. Зайцев, В. А. Воробьев

ФГБУ «Сибирский федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства» (ЗАТО Северск)

Исследована биологическая безопасность биодеградируемого матрикса с заданными физико-химическими характеристиками, полученного из полимолочной кислоты методом аэродинамического формирования в турбулентном газовом потоке. При проведении сравнительного анализа жизнеспособности клеток костного мозга крыс в условиях in vitro было доказано отсутствие цитотоксичности у тестируемого синтетического полилактидного матрикса. Согласно результатам теста исследуемый материал апирогенен.

Ключевые слова: биодеградируемые полимеры, цитотоксичность, апирогенность.


Введение. Создание новых материалов, предназначенных для контакта со средой живого организма и необходимых для реконструктивной и регенеративной медицины, является одной из ключевых проблем современной биомедицинской науки. Разнообразие физико-механических характеристик искусственных материалов и покрытий позволяет разрабатывать технологии целенаправленного воздействия на функционирование различных биологических систем [4]. С другой стороны, продукты износа имплантатов и покрытий (в частности, ионы и наночастицы) могут обладать выраженным стимулирующим или цитотоксическим действием [6].

Искусственные матриксы определяют механические свойства и форму имплантата, формируют субстрат для адгезии клеток. Кроме того, субстрат выступает в качестве депо для растворимых факторов роста, а многие субстраты содержат сигнальные последовательности, относящиеся к классу нерастворимых биологически активных веществ. Регуляторные факторы субстрата влияют на репертуар синтезируемых клетками компонентов внеклеточного матрикса, являющихся источником сигналов, определяющих функциональное состояние клетки. Таким образом, субстрат активно участвует в инструктировании клеточного морфо- и фенотипа, а также межклеточных взаимодействий [1].

Новым направлением приложения полимеров в области регенеративной медицины является разработка трехмерных волокнистых структур (нетканых скеффолдов), имеющих высокое отношение площади поверхности к общему объему, имитирующих межклеточное волокнистое вещество различных тканей. Развиваемая концепция биосовместимых материалов позволяет на стадии их изготовления задавать точные параметры микрорельефа (шероховатость, пористость, поверхностный потенциал, элементный и фазовый составы, гидрофильность), которые предположительно могут определять вектор дифференцировки клеток [5]. Тем не менее, стандарты качества требуют многостороннего тестирования in vitro и in vivo каждого нового материала и/или изделия перед его использованием в медицине.

В связи с этим целью настоящего экспериментального исследования явилась оценка цитотоксичности и апирогенности гибридного синтетического биодеградируемого полилактидного матрикса с заданными физико-химическими характеристиками.

Материалы и методы исследования. Для изучения цитотоксичности гибридного синтетического биодеградируемого полилактидного матрикса использовали стерильные образцы с линейными размерами 10 × 10 мм и толщиной не более 1 мм. По одному матриксу размещали в лунки 24-луночных планшетов («Orange Scientific», Бельгия) и добавляли взвесь костного мозга, свежевыделенного из бедра крысы. В контрольные лунки помещали взвесь клеток без тестируемых объектов. В каждой группе было по 5 матриксов. Конечная концентрация миелокариоцитов в лунках составила 5,0 × 106 жизнеспособных ядросодержащих клеток в 1 мл полной культуральной среды, содержащей 85 % среды DMEM/F12 («Gibco», США), 15 % инактивированной нагреванием сыворотки крови эмбрионов коров («Sigma», США), 280 мг/л L-глутамина («Sigma», США), 8 мл/л смеси пенициллин/стрептомицин («Sigma», США). Клетки культивировали в атмосфере 5 % углекислого газа в течение 1 ч при температуре 37 °С и 100 % влажности.

В клеточной взвеси рассчитывали индекс цитотоксичности через определение процента погибших (окрашенных красителем) или выживших (неокрашенных) клеток после контакта с объектом исследования. Для этого 100 мкл клеточной суспензии смешивали с равным объемом красителя 0,4 % трипановый синий, перемешивали жидкости в течение 20 сек и в камере Горяева подсчитывали количество окрашенных (погибших) клеток на 100 встреченных при подсчете клеток.

Экспериментальное исследование апирогенности было выполнено на 20-ти половозрелых крысах-самцах породы Wistar массой 280–300 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Под CО2-наркозом в ламинарном потоке стерильного воздуха 10-ти крысам имплантировали подкожно (в область живота) по 1-му матриксу через кожный разрез. В качестве контроля служила группа из 10-ти ложнооперированных животных, которым выполняли срединный разрез кожи, подкожно вводили пинцет, формировали боковой карман и зашивали рану без введения изделия. Для оценки возможной гипертермической реакции у крыс контрольной и опытной групп проводили измерение ректальной температуры до операции и на 1, 2, 3 и 7-е сутки после операции.

При обработке полученных данных были использованы методы статистического описания, включающие проверку на нормальность распределения исследуемого признака по критерию Шапиро-Вилка, расчет среднего (`Х), ошибки среднего (m), межгрупповое сравнение показателей с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считались статистически значимыми при уровне р < 0,05.

Результаты исследований и обсуждение. Для исследования нам были предложены трехмерные нетканые матриксы, изготовленные в Национально-исследовательском Томском политехническом университете методом аэродинамического формования в турбулентном газовом потоке из 4 % раствора полимолочной кислоты с молекулярной массой 92000 г/моль в дихлорэтане [7].

В условиях in vitro ответ клеток различается в зависимости от состава искусственных материалов. Для изделий с предполагаемым внедрением в область биоинженерии костный мозг является подходящей тест-системой, поскольку содержит стволовые клетки различных дифферонов и активно применяется для биотестирования материалов [2].

Результаты экспериментов in vitro показали, что количество выживших клеток при 1-часовом контакте клеточной суспензии и тестируемого матрикса составило 96,80 ± 0,97 %, что статистически значимо не отличалось от показателя в контрольной культуре клеток, не контактировавших с искусственным материалом (96,80 ± 0,97 %). Макроскопическое изучение поведения матрикса в клеточной взвеси показало, что он находился на границе раздела воздух/жидкость. В то же время клетки под действием силы тяжести опускались на дно культуральной посуды (установлено при микроскопическом исследовании). Таким образом, влияние матрикса на жизнеспособность миелокариоцитов было как прямым, так и опосредовано через продукты биодеградации тестируемых образцов, выделяющиеся из материала при контакте с модельной биологической жидкостью.

Получить апирогенный продукт — одно из основных требований, предъявляемых к имплантируемым материалам. Пирогенная реакция выражается повышением температуры тела, ознобом и другими симптомами. Причиной такой реакции часто являются эндотоксины грамотрицательных бактерий, которые при внутреннем введении обладают значительно большей активностью, чем при накожном нанесении [3].

Для оценки возможной гипертермической реакции у крыс контрольной и опытной групп проводили измерение ректальной температуры до подкожной имплантации исследуемого полилактидного матрикса и на 1, 2, 3 и 7-е сутки после операции. Согласно полученным данным статистически значимых изменений температурной реакции во все сроки у экспериментальных животных выявлено не было (см. табл.).

Таким образом, тестируемый гибридный синтетический биодеградируемый полилактидный матрикс не вызывал гипертермической реакции организма крыс при имплантации, т. е. апирогенен.

Температура тела у крыс при подкожной имплантации гибридного синтетического биодеградируемого матрикса из полимолочной кислоты (`Х ± m)

Группа животных Температура тела, °С
до операции 1-е сутки после операции 2-е сутки после операции 3-и сутки после операции 7-е сутки после операции
Ложно-оперированные крысы 38,3 ± 0,9 39,5 ± 0,3 38,6 ± 0,5 38,0 ± 0,7 38,5 ± 0,8
Крысы с имплантированным полилактидным матриксом 38,2 ± 0,7
р > 0,05
39,4 ± 0,4
р > 0,05
38,8 ± 0,6
р > 0,05
38,5 ± 0,4
р > 0,05
38,4 ± 0,6
р > 0,05

Примечание: р — уровень статистической значимости различий показателя у крыс опытной группы по сравнению с аналогичным показателем у ложно-оперированных животных

Согласно проведенным тестам, исследуемый материал может быть представлен на испытания биосовместимости и биоактивности в системах in vivo для решения различных биоинженерных задач.

Выводы

  1. При проведении сравнительного анализа жизнеспособности клеток костного мозга крыс в условиях in vitro было доказано отсутствие цитотоксичности у тестируемого синтетического полилактидного матрикса.
  2. Гибридный биодеградируемый синтетический матрикс из полимолочной кислоты является апирогенным изделием, поскольку при подкожной имплантации лабораторным крысам не вызывал повышения температуры тела.

Список литературы

  1. Локальные и системные эффекты имплантатов гиалуроновой кислоты при коррекции возрастных изменений кожи / И. А. Хлусов [и др.] // Бюллетень сибирской медицины. — 2013. — Т. 12, № 1. — С. 61–68.
  2. Регуляция поведения клеток фосфатами кальция in vitro, синтезированными механохимическим методом / А. В. Карлов [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2004. — Т. 138, № 9. — С. 356–360.
  3. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. А. Н. Миронова. — Ч. 1. — М. : Гриф и К, 2012. — 944 с.
  4. Biomaterials science : an introduction to materials in medicine / Ed. by B. D. Ratner. — San Diego : Elsevier Academic Press, 2004. — 851 p.
  5. Lutolf M. P. Designing materials to direct stem-cell fate / M. P. Lutolf, P. M. Gilbert, H. M. Blau // Nature. — 2009. — Vol. 462. — P. 433–441.
  6. Nanotech-nology for cell-substrate interactions / N. J. Sniadecki [et al.] // Annals of Biomedical Engineering. — 2006. — Vol. 34. — P. 59–74.
  7. Nonwoven Polylactide Scaffolds Obtained by Solution Blow Spinning and the In Vitro Degradation Dynamics / S. Tverdokhlebov [et al.] // Advanced Materials Research. — 2014. — Vol. 872. — Р. 257–262.

 

Учредитель: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России)

Государственная лицензия ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России
на образовательную деятельность:
серия ААА № 001052 (регистрационный № 1029) от 29 марта 2011 года,
выдана Федеральной службой по надзору в сфере образования и науки бессрочно

Свидетельство о государственной аккредитации ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России:
серия 90А01 № 0000997 (регистрационный № 935) от 31 марта 2014 года
выдано Федеральной службой по надзору в сфере образования и науки
на срок по 31 марта 2020 года

Адрес редакции: 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, д. 52
тел./факс: (383) 229-10-82, адрес электронной почты: mos@ngmu.ru

Выпуск сетевого издания «Медицина и образование в Сибири» (ISSN 1995-0020)
прекращен в связи с перерегистрацией в печатное издание «Journal of Siberian Medical Sciences» (ISSN 2542-1174). Периодичность выпуска — 4 раза в год.

Архивы выпусков «Медицина и образование в Сибири» доступны на сайте с 2006 по 2016 годы, а также размещены в БД РИНЦ (Российский индекс научного цитирования) на сайте elibrary.ru.

Средство массовой информации зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор) —
Свидетельство о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-72398 от 28.02.2018.

© ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России, 2020



22.05.2017
Сетевое издание «Медицина и образование в Сибири» преобразовано в печатное издание «Journal of Siberian Medical Sciences». Дата перерегистрации: 18.05.2017. Свидетельство о СМИ: ПИ № ФС 77-69793.
Подробнее >>

03.04.2017
С 2017 года Издательско-полиграфическим центром НГМУ осуществляется выпуск печатного издания «Сибирский медицинский вестник».
Подробнее >>

08.02.2016
Уважаемые авторы! Открыт прием статей во 2-й номер 2016 года (выход номера — середина мая 2016 г.).
Подробнее >>

11.01.2016
Уважаемые авторы! Продолжается прием статей в 1-й номер 2016 года (выход номера — конец февраля 2016 г.).
Подробнее >>

28.12.2015
Уважаемые авторы! Сетевое издание входило в Перечень ВАК до 30 ноября 2015 г. Работа по включению издания в новый Перечень ВАК продолжается.
Информация о формировании Перечня ВАК
Подробнее >>

Архив новостей


Rambler's Top100